1.病原学检查 加热可疑食物、呕吐物或排泄物，煮沸20min接种血琼脂血琼脂作为厌氧菌培养，发现致病菌。对于创伤性肉毒杆菌中毒，在血清中发现毒素或从伤口中分离，在厌氧条件下培养肉毒杆菌可以明确诊断.婴儿肉毒杆菌毒素中毒需要与脓毒症、先天性肌肉营养不良、脊柱肌肉萎缩、甲状腺功能减退和良性先天性肌肉张力减退相鉴别.在粪便中发现肉毒杆菌毒素或细菌可以确诊。
2.毒素试验
(1)动物试验:将检查标本浸出液体喂养动物，或注射豚鼠和小白鼠腹腔，并设置对照组加热80℃ 30min在标本中加入混合肉毒杆菌毒素或抗毒素。如果试验组动物死于肢体麻痹，而对照组没有，则可以建立疾病的诊断。
(2)中和试验:各种抗毒素血清0.5ml注射小白鼠腹腔，然后接种标本0.5ml，同时设置对照组，判断毒素和定型。
(3)禽眼接种试验:根据禽类的大小，使用含有毒素的浸出液0.1～0.3ml在家禽眼内角以下的眼睑皮下注射眼睑闭合，或麻痹性瘫痪和呼吸困难，几十分钟到几小时后死亡，可作为快速诊断。
3.肌电图检查 肌纤维振动，单刺激反应减少，反复刺激电势增加，具有持续时间短、波幅小、多相运动、电势增加等特点，有利于本病的诊断。
