1.外周血象 白细胞总数正常或略有增加。
2.病毒分离 它是诊断的主要方法，具有节约、快速、准确的优点，避免了血清方法遇到的各种血清困难。
病毒从粪便中分离的阳性率最高，发病后10天内仍可阳性。36h病毒可以在发烧期间从血液中分离出来。呼吸道感染者可以从咽喉或咳嗽液中分离病毒。脑脊液中分离病毒阳性率低，但诊断意义重大。其他标本包括胸腔积液、心包积液、尿液、肌肉活检组织和尸检神经组织。粪便标本可以保存在4℃其他标本需要保存多日-7℃以下。
病毒从粪便和呼吸道中分离只有参考意义，因为它们可能是合并感染。病毒从血液、脑脊液和心包积液中分离具有诊断意义。因此，应尽可能从多个来源收集标本，以提高结果的可靠性。
柯萨奇A组病毒除A9和A16除了细胞培养和分离病毒外，其他血清类型还需要通过各种方式（皮下、腹腔、大脑等）接种乳鼠来分离病毒。首先观察病理变化，然后用特异性抗血清作为中和试验进行证实。最近使用RD柯萨奇细胞(人横纹肌瘤细胞)纹肌瘤细胞)A1、A19、A22除了类型病毒A分离柯萨奇B组织培养是组织病毒的首选，常用的细胞株有猴肾、人胚肾和Hela非洲绿猴肾细胞(BGM)细胞株和RD细胞株效果更好。2~5天后，观察细胞病变进行初步诊断，然后用特异性抗血清中和试验进行鉴定。整个过程大约需要1~3周，但作为临床诊断，无需等待血清鉴定结果。
3.血清学检查 仅适用于以下情况：①将病毒分离为确定血清型时；②发现流行性胸痛等特征性临床表现明显表明使用某些特定抗原(如B科萨奇通常用于检测抗体时的手、脚和口腔疾病A16型病毒引起时；③由单一血清病毒引起的流行；④用于特定血清型血清流行病学调查。
在血清学检测方法中，中和试验是识别分离病毒血清型最特殊的方法。然而，作为检测肠道病毒感染的抗体，中和试验不够敏感，操作复杂，价格昂贵。患者在病程第二周开始中和抗体，达到高峰2~3周，并保持3~6年。补体结合试验特异性低，异形抗体出现率高。但补体结合抗体与中和抗体同时出现，仅保持2~3个月，可作为近期感染的依据。血凝抑制试验用途不大，因为只有三分之一的肠道病毒产生红细胞凝集素，即使在同一血清型中，也可以产生一些毒株，而其他毒株不产生红细胞凝集素。最近有报道采用免疫印记法进行检测IgM肠道病毒抗体呈阳性60％，大多数是群体特异性（22/31），少数是群体特异性。通过胎盘和母乳，有型特异性中和抗体和补体结合抗体被动地从母亲转移到婴儿身上。肠道内的局部抗体也有保护作用。据报道，热处理病毒是抗原，合成肽是抗原ELISA法检测IgG抗体的敏感性(以病毒分离为对照)分别为0.67和0.62，高于补体结合试验。56例病毒分离为阴性，IgG-ELISA临床诊断适用于双份血清滴度显著升高的13例和19例。
近年来，陆续报道使用PCR血清中肠道病毒RNA，灵敏度和特异性高，阳性率明显高于细胞培养分离病毒。
