发布于 2024-03-08 来源：复禾疾病百科
1.采集标本 用无菌棉拭子蘸腹泻患者粪便，如无粪便，直肠拭子浸泡磷酸盐缓冲液插入肛门4～6cm(婴幼儿2～3cm)在直肠内旋转擦拭直肠表面粘液后，取出，放入运输或储存液中。如果不能及时检查，样品应在4℃冷藏，但不得超过8h为宜。
2.增菌和分离培养 大肠埃希杆菌的分离应选择弱选择性培养基，如伊红亚甲蓝和中国蓝玫瑰酸山梨醇麦康凯平板。划线分离，35～37℃培养18～24h之后，观察菌落的形态特征，选择紫红色或深红色1～3mm、鉴定边缘整齐有光泽，中央凸起的单个菌落，鉴定程序见图1。
3.鉴定
（1）初步识别：根据菌落特征、涂层染色的菌形和染色反应，生化反应如图1所示，所有符合表1所示的结果均可初步识别为大肠埃希杆菌。
（2）最终鉴定：一般常规检查可实现上述初步鉴定，必要时可根据据伯杰系统细菌学手册中列出的生化反应进行最终鉴定。主要鉴定试验为：阳性触酶和阴性氧化酶；发酵葡萄糖产酸气或只产酸，发酵乳糖产酸气或缓慢发酵产酸，不发酵肌醇；IMVC反应分别为 ，-，-(占94.6％);脲酶阴性，H2S阴性、苯丙氨酸脱氨酶阴性、硝酸盐还原阳性、大部分功率阳性。简单的方法是根据反应结果编码肠杆菌试剂盒进行最终识别。
(3)鉴定试验:一些大肠埃希杆菌，尤其是无动力的非发酵乳精株，应与志贺菌相鉴别。醋酸钠和葡萄糖铵和粘质酸产酸可用于两者的主要鉴别试验。大肠埃希杆菌呈阳性，而志贺菌呈阴性。
①致病性大肠埃希杆菌：
A.假设试验：在平板上细菌生长密集的地方选择培养物EPEC的3种多价O血清作为玻片凝集试验。例如，与某种多价格O血清凝集，然后与多价血清相结合O单价血清试验。例如，与某个血清。O单价血清凝集，然后选择3～5单个菌落，用血清凝集试验。
B.生化试验：选择O单价血清强凝菌落接种三糖铁琼脂，悬挂靛蓝基质试纸，经过36℃培养18～20h。凡是乳糖、蔗糖产酸，葡萄糖产酸并多数产气，H2S阴性、靛蓝基质阳性菌株可证实为大肠埃希杆菌。如果靛蓝基质呈阴性，则必须V-P试验为阴性，且不能在西蒙枸橼酸盐琼脂上生长，方可证实为大肠埃希杆菌。
C.血清学证实试验:将三糖铁琼脂上的培养物刮去，用生理盐水制成菌悬液，稀释至与MacFarland 3号的浓度相当于浊管。0单价血清如果原效价在1∶(160～320)，则可l∶40稀释(用0.5％盐水)。在10mm×75mm在试管中，稀释的抗血清与菌悬液等量混合50.6℃水温中16h观察结果后。如果有凝集，可以证明是这样。O因子。
②出血性大肠埃希杆菌:已知为出血性肠炎患者的粪便，可以用山梨醇代替乳糖的麦康凯琼脂平板接种。培养后，选择3～5个山梨醇不发酵的菌落，以O157血清(最好同时使用H7血清)作为玻片凝集试验和单管凝集试验来确定诊断。
分离菌株应接种三糖铁琼脂，悬挂靛蓝基质试纸，经过36℃培养18～20h。乳糖、蔗糖产酸、葡萄糖产酸等典型生化特征，H2S阴性，靛蓝基质阳性。山梨醇发酵管接种缓慢发酵。
③毒性大肠埃希杆菌：
A.生化试验：在鉴别板上选择5种可凝菌落，一般选择乳糖发酵的典型菌落，分别接种三糖铁琼脂，悬挂靛蓝基质试纸，36℃培养18～20h。凡是乳糖、蔗糖产酸，葡萄糖产酸并多产气，H2S阴性、靛蓝基质阳性菌株可证实为大肠埃希杆菌。如果靛蓝基质呈阴性，则必须V-P试验阴性，不能在西蒙柠檬酸盐琼脂上生长，可证实为大肠埃希杆菌。
B.肠毒素试验：产毒性大肠埃希杆菌主要通过肠毒素试验得到证实。肠毒素试验的方法有很多。目前，我国采用双相琼脂扩散试验LT，测定乳鼠灌胃试验ST，有时也采用家兔结扎回肠段试验进行测定LT和ST。
这两种肠毒素已经通过基因诊断来确定。
a.双向琼脂扩散试验：将被检菌株按5点环形接种Elek在培养基上，以同样的操作，共做两份36℃培养48h。多粘菌素放在每株菌苔上B纸片，于36℃经5～6h，使肠毒素渗入琼脂。在离菌苔中5mm在中心，挖一个直径4mm圆孔，用一滴琼脂垫底。在孔内滴加LT抗毒素30µl，并用已知产LT对比无毒菌株。36℃培养15～20h观察结果。白色沉淀带在菌斑和抗毒素孔之间呈阳性，否则呈阴性。
b.乳鼠灌胃试验：将被检菌株接种Honda产毒肉汤，于36℃培养24h，3000r/min离心30min，取上清液通过薄膜滤器过滤，60℃加热30min，加入每毫升滤液2％伊文思蓝溶液0.02ml。用塑料管注入滤液1～4天龄乳鼠胃0.1ml，同时接种3～4只。禁食3～4h氯仿麻醉后，取出所有肠道，称重肠道（包括积液）的重量和剩余体重。肠道重量与剩余体重之比大于0.09为阳性，0.07～0.09为可疑。
c.家兔结扎回肠段试验：将被检菌株接种Honda产毒肉汤，于36℃培养24h，3000r/min离心30min，取上清液，通过膜滤器过滤。滤液分为两部分，一部分不加热，供测LT用;另一份60℃加热30min，供测ST用。取体重2kg家兔，禁食一天。麻醉后剖腹产，取出回肠段，按压10～15cm分段结扎。取一段肉汤注射2ml作为阴性对照，注射已知产毒菌肉汤培养物的另一段过滤液2ml作为阳性对照。其他部分分别注射待试菌株肉汤培养物的2ml，缝合腹壁ST时间，注射后6～8h剖腹检查；测量LT时间，注射后18h剖腹检查。提取各肠段的滤液，测量其容量和长度。(ml)与肠段长度(cm)比例大于1为阳性。
d.血清学试验：肠毒素试验阳性菌株ETEC有关的多价O为了确定血清和单价血清作为玻片凝集试验O抗原。
④侵袭性大肠埃希杆菌：
A.生化试验：在鉴别板上挑选菌落3～5一般来说，不发酵乳糖的菌落贺菌的非发酵乳糖菌落，但也可以适当选择发酵乳糖的优势菌落。接种半固体管，36℃培养18～24h。除非血清学认定为0124，否则可以放弃动态菌株。留下无动力菌株，接种三糖铁琼脂，悬挂靛蓝基质试纸，36℃培养18～20h。赖氨酸脱羧酶试验同时进行。EIEC典型的生化特征是：乳糖、蔗糖不产酸或产酸、葡萄糖产酸、产气或产气，H2S阴性、靛蓝基质阳性、赖氨酸脱羧酶阴性O124外均无动力。赖氨酸脱羧酸试验亦可以放在血清学试验以后做。
B.血清学试验：选用三糖铁琼脂培养物EIEC的两个多价O确定血清作为玻片凝集试验O抗原成分。
C.豚鼠角膜试验：将菌液滴入豚鼠眼内2～5观察天内是否有红肿、流泪、充血症状。
D.ELISA测试：使用已知EIEC或者志贺菌属有毒菌株免疫贺菌属的有毒菌株免疫兔。ELISA法测定，EIEC各种有毒菌株和志贺菌属于各种有毒菌株都是阳性的。该方法是用基因探针法检测被检测菌的侵袭性肽。
⑤聚集性大肠埃希杆菌：聚集性大肠埃希杆菌(EAEC)其重要特征是Hap-2细胞周围形成特征性的集聚性黏附。Yamamoto发现在37℃培养时，EAEC这种聚集粘附可以发生在某些液体培养基的生长表面，形成厚厚的粘附聚集菌块。25℃或42℃没有这种现象，液体培养基L或M-H培养基最好，可以作为EAEC初步鉴定手段。液体培养基菌块形成试验：大肠埃希杆菌接种M-H液体培养基(Difco)，35～37℃温育18～24h，表面(部分下沉管底)形成菌块的为阳性，均匀混浊的为阴性。1996年，王梅等人对肠道有凝聚力-对粘附性大肠埃希杆菌进行简单的筛查试验M-H培养基上的菌块形成试验Hep-2对比细胞粘附试验，发现两者的一致性达到77％，包括弥散型和局限型在内的达88.5％。表明块形成试验是可靠的初步筛选EAggEC的方法。
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