1、X线所见：腹部立位平板大多表现为低结肠梗阻。典型的痉挛性肠段和扩张性肠段可在钡灌肠侧和前后位的照片中看到。钡排放功能差，24小时后仍有钡剂。如果钡剂不及时灌肠和洗涤，可形成钡石。结合肠炎时，肠壁扩张呈锯齿状，新生儿期肠管扩张超过出生后半个月。如仍未确诊，应进行以下检查。
2.肛门直肠测压法:确定直肠和肛门括约肌的反射性压力变化，可诊断先天性巨结肠，识别其他原因引起的便秘。在正常儿童和功能性便秘中，当直肠受到膨胀刺激时，内括约肌立即反射性放松，压力下降，先天性巨结肠儿童内括约肌不仅不放松，而且明显收缩，使压力增加。这种方法有时会在10天内产生假阳性结果。
3.活体组织检查:取距肛门4cm检查神经节细胞数量，巨结肠儿童缺乏节细胞。
4.直肠粘膜组织化学检查方法:这是根据痉挛段粘膜和肌神经节细胞缺乏增生，肥大副交感神经节纤维不断释放大量乙酰胆碱和胆碱酶，化学方法可确定数量和活性是正常儿童5~6倍，有助于诊断先天性巨结肠，可用于新生儿。
