1.活体组织检查
肛门取距4cm以上直肠壁粘膜下层及肌层一小块组织，检查神经节细胞的数量，巨结肠患儿缺乏节细胞。
2、肛门直肠测压法
测量直肠和肛门括约肌反射压力变化，可诊断先天性巨结肠，识别便秘等原因，正常儿童和功能性便秘，当直肠膨胀刺激时，括约肌反射放松，压力下降，先天性巨结肠儿童括约肌不仅不放松，而且明显收缩，使压力增加，10天内新生儿有时会出现假阳性结果。
3、直肠粘膜组织化学检查法
这是根据痉挛段粘膜和肌神经节细胞缺乏增生，肥大的副交感神经节纤维不断释放大量乙酰胆碱和胆碱酶，通过化学方法可以确定两者的数量和活性比正常儿童5～6倍，有助于对先天性巨结肠的诊断，并可用于新生儿。
